輻射誘導的雙鏈斷裂可在無廣泛切除的情況下發(fā)生重組修復

2019-10-18 09:28

文章背景簡介

BACKGROUND INTRODUCTION

修復雙鏈斷裂（DSB）的機制一般有兩種，一種涉及重組以精確地恢復斷裂區(qū)域中的遺傳信息，另一種是易錯的末端連接，可能與斷裂末端之間的微同源性關聯(lián)。末端切除通常被認為是在兩種修復機制之間選擇的關鍵決定因素。雖然切除通常被認為在DSB重組修復中起關鍵作用，但目前還沒有直接評估“臟”DSB（例如輻射誘導的DSB）的切除量與修復效率之間關系的研究。在“干凈”的DSB（例如通過HO內切酶或I－SceI內切酶誘導發(fā)生的DSB）處切除被描述為是兩步過程：其中MRX（萌芽酵母中的Mre11 ／ Rad50 ／ Xrs2；哺乳動物細胞中的MRN）和Sae2（CtIP）的作用僅限于最初的短切除步驟（＜50–100個堿基），然后由Exo1和／或Sgs1 ／ Dna2的組合進行廣泛切除，可跨越數(shù)千個堿基。在沒有MRX或Sae2的情況下，Exo1或Sgs1 ／ Dna2可以啟動切除——盡管這一作用的效率較為低下。

電離輻射（IR）是DSB的常見來源，也是癌癥治療中使用的最常見的試劑之一。IR－DSB的切除速率約為每小時1－2kb，并且基于恢復染色體數(shù)量的增加，基因組中近50％的IR－DSB在半小時內修復。

美國國家衛(wèi)生研究院James W． Westmoreland等人2019年在《Nucleic Acids Research》（IF 11．147，生物1區(qū)）發(fā)表了題為“Recombinational repair of radiation－induced double－strand breaks occurs in the absence of extensive resection”的研究。研究了在沒有大范圍切除的情況下輻射誘導的雙鏈斷裂發(fā)生重組修復。

所用到的主要方法

METHODS

1．脈沖電泳實驗

2．southernblot轉移雜交

3．DSB的量化

文章主要內容摘要

ABSTRACT

重組修復在雙鏈斷裂（DSB）誘導后提供精確的染色體修復。雖然所有DSB重組修復模型都包括5－3切除，但目前還沒有研究直接用于輻射（IR）誘導的“臟”DSB隨機細胞中G－2期姐妹染色單體修復所需的切除。本研究使用脈沖場凝膠電泳移位方法確定了WT和EXO1核酸外切酶或Sgs1解旋酶的突變體在IR－DSB處的切除。缺少二者任何一個會使得切除長度減少一半，但并沒有減少DSB修復水平或細胞存活率。在Exo1Δsgs1Δ雙突變體中，幾乎檢測不到切除，但只需要額外的一個小時就能達到與WT相當?shù)男迯退剑⑶覍毎媛手挥?成的劑量有調節(jié)效果Dnl4缺失菌株的結果表明，剩余的修復不是由于末端連接。因此，與單個干凈的HO誘導的DSB相似，切除長度的嚴重縮短對G2阻滯細胞中多個“臟”的DSB的再配對僅產生輕微的影響。值得注意的是，這項研究首次將DSB的切除長度與姐妹染色單體之間的全局重組修復能力直接聯(lián)系起來。

本研究首次演示了IR－DSB誘導姐妹染色單體之間的分子重組體，這通過線性二聚體分子的產生來證明，這也包括重組體可能是如何形成的描述。實驗表明在DSB的兩端有一致的切除起始，這是由于末端之間的切除的協(xié)調。MRX已被證明在確定的DSB處開始切除，隨后通過Exo1或Sgs1／DNA2進一步廣泛切除。核酸酶的丟失減少了單個“干凈”DSB的切除，導致通過單鏈退火減少了對放置在直接重復之間的單個“干凈”DSB的修復。本文研究表明缺少Exo1或Sgs1／DNA2會導致IR－DSB的切除率降低一半，而對DSB修復幾乎沒有影響。Exo1和Sgs1／DNA2的聯(lián)合丟失導致幾乎檢測不到的IR－DSB切除水平。盡管如此，DSB的修復或存活率只有相對較小的降低，這表明在對照組細胞中的切除比修復或產生重組二聚體分子所需的切除要多得多。重要的是，本研究證明了低切除修復是由于重組而不是末端連接。這些結果得出了一個耐人尋味的可能性，酵母和脊椎動物中DSB的重組修復可能在機制上比以前認識到的更相似。