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Sanger雙脫氧鏈終止法是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開(kāi)始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，并且在每個(gè)堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長(zhǎng)度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得可見(jiàn)DNA堿基序列的一種方法。

一代測(cè)序結(jié)果圖，橫軸是電泳時(shí)間，縱軸是熒光強(qiáng)度，橫軸也是堿基的先后次序。峰越高、越尖，與別的峰交錯(cuò)越少，則這個(gè)堿基判讀準(zhǔn)確性越好。結(jié)果肉眼可見(jiàn)，直觀而準(zhǔn)確。

二代測(cè)序：第二代DNA測(cè)序技術(shù)又稱高通量測(cè)序技術(shù)（High－throughput sequencing， HTS），以低成本、較高的準(zhǔn)確度，一次可對(duì)幾百、幾千個(gè)樣本的幾十萬(wàn)至幾百萬(wàn)條DNA分子同時(shí)進(jìn)行快速測(cè)序分析。這一時(shí)期的代表技術(shù)有 Roche公司的454（已退市）、Illumina公司的Solexa（已升級(jí)到Novaseq，市場(chǎng)份額第一）和ABI公司的SOLID（由ThermoFisher公司收購(gòu)，已升級(jí)到Ion Torrent S5），由于該時(shí)期的測(cè)序技術(shù)十分前沿，因而市場(chǎng)主要被這三家公司所壟斷。其測(cè)序技術(shù)復(fù)雜，生成測(cè)序文件數(shù)據(jù)量巨大，后續(xù)生物信息處理難度高，因此近5年才逐步進(jìn)入臨床，且多用于腫瘤精準(zhǔn)用藥的部分。

以illumina為例，我們簡(jiǎn)單介紹一下其測(cè)序流程。

①將目的DNA分子打斷成100－200 bp的片段，隨機(jī)連接到固相基質(zhì)上，經(jīng)過(guò)Bst聚合酶延伸和甲酸胺變性的橋PCR循環(huán)，生成大量的DNA簇（DNA cluster），每個(gè)DNA 簇中約有超過(guò)1000個(gè)相同序列的DNA片段。

②之后的反應(yīng)與Sanger法類似，加入用4種不同熒光標(biāo)記并結(jié)合了可逆終止劑的dNTP。固相基質(zhì)上每個(gè)孔有八道獨(dú)立檢測(cè)的位點(diǎn)，所以一次可以并行八個(gè)獨(dú)立文庫(kù)，可容納數(shù)百萬(wàn)的模版克隆，可把多個(gè)樣品混合在一起檢測(cè)，每個(gè)固相基質(zhì)上一次可讀取10億個(gè)堿基。

③DNA簇與單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物的通用序列雜交，由于終止劑的作用，DNA聚合酶每次循環(huán)只延伸一個(gè)dNTP。每次延伸所產(chǎn)生的光信號(hào)被標(biāo)準(zhǔn)的微陣列光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)分析測(cè)序，下一次循環(huán)中把終止劑和熒光標(biāo)記基團(tuán)裂解掉，然后繼續(xù)延伸dNTP，實(shí)現(xiàn)了邊合成邊測(cè)序技術(shù)。

④其主要的缺點(diǎn)是由于光信號(hào)衰減和移相的原因使得序列讀長(zhǎng)較短，可以進(jìn)行每個(gè)DNA測(cè)序片段的閱讀長(zhǎng)度較短，目前主流且成本最低的就是做雙端測(cè)序150bp（PE150）。我們測(cè)全外顯子組的策略也是PE150。

二代測(cè)序原理，通過(guò)簇生成，CCD捕獲結(jié)合到模板的dNTP發(fā)的熒光，確定其DNA序列。

二代測(cè)序完成后，由于數(shù)據(jù)量巨大，復(fù)雜和多樣，因此，結(jié)果是肉眼不可見(jiàn)的，需要專業(yè)的算法、流程將原始數(shù)據(jù)處理為可用的數(shù)據(jù)。可比喻為，測(cè)序只是去菜場(chǎng)買(mǎi)菜，算法則是把菜做成大餐的過(guò)程。這個(gè)過(guò)程需要超級(jí)計(jì)算機(jī)，建立好的優(yōu)秀算法以及精通生物信息學(xué)分析的人員。

二代測(cè)序分析流程中，需要將原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控后生成一系列的中間文件（左圖），通過(guò)繁瑣的生物信息學(xué)流程（中圖），最后拼接成我們想要的基因。目前全流程多用Python和Perl語(yǔ)言在服務(wù)器上實(shí)現(xiàn)（右圖）。

二代測(cè)序由于其原理的一些問(wèn)題，導(dǎo)致必須同一個(gè)位點(diǎn)測(cè)多次，才能保證數(shù)據(jù)的可靠性。一般用于臨床的數(shù)據(jù)，需要同一位點(diǎn)測(cè)序后出現(xiàn)200次以上。我們將這樣的方案叫做測(cè)序深度（＞200 X）。二代測(cè)序的優(yōu)勢(shì)是巨大的，其數(shù)據(jù)量巨大，可短時(shí)間高效率對(duì)人類基因組測(cè)序，并發(fā)現(xiàn)大量未知位點(diǎn)。單個(gè)位點(diǎn)成本降低，是個(gè)性化醫(yī)療和精準(zhǔn)用藥的基礎(chǔ)。

最后，還有一種類似測(cè)序的工具，叫做基因芯片。基因芯片的原型是80年代中期提出的。基因芯片的測(cè)序原理是雜交測(cè)序方法。目前由國(guó)內(nèi)外幾家大廠家所壟斷。其優(yōu)點(diǎn)是信息量較大，比一代測(cè)序的識(shí)別位點(diǎn)極大提升，可批量化生產(chǎn)并有完全標(biāo)準(zhǔn)流水線工作。但其缺點(diǎn)也很明顯，成本仍較高，無(wú)技術(shù)門(mén)檻，只檢測(cè)已選擇好的位點(diǎn)，更新位點(diǎn)的時(shí)間和經(jīng)費(fèi)成本較高。比如illunima公司的ASA芯片，就是在一塊芯片上集成了66萬(wàn)個(gè)人類基因組位點(diǎn)，檢測(cè)信息量大約30m左右。

2001年，通過(guò)一代測(cè)序，耗資37億美元，耗時(shí)13年，獲得了人類基因組草圖。到了2007年，用二代測(cè)序完成第一個(gè)完整的人類基因組序列圖譜只花費(fèi)了150萬(wàn)美元，耗時(shí)3個(gè)月。到了2020年，人類基因組測(cè)序只需要不到1萬(wàn)元人民幣即可完成測(cè)序工作，時(shí)間只需要3天。近年來(lái)，測(cè)序技術(shù)突飛猛進(jìn)，隨著測(cè)序單價(jià)的不斷降低，我們必將見(jiàn)證人人都有“基因身份證”的那一天。