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AOC的工藝制造與質量控制

2026-03-25 14:06

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引言

隨著抗體-寡核苷酸偶聯(lián)藥物（AOCs）從概念驗證加速進入臨床開發(fā)階段，建立與之匹配的、嚴謹?shù)馁|量控制體系并深刻理解其面臨的臨床轉化挑戰(zhàn)，已成為推動該領域成熟的關鍵。AOCs作為一種由大分子抗體與化學大分子寡核苷酸通過連接子共價結合而成的復雜實體，其結構異質性高，生產(chǎn)過程涉及多步合成與純化。為確保最終產(chǎn)品的安全性、有效性和批次間一致性，必須建立一套從中間體到成品的全方位質量控制策略。其質量控制遠非兩者簡單的疊加，而是需要對寡核苷酸-抗體比率（OAR）、偶聯(lián)位點、游離雜質及生物活性等獨特屬性進行多維度的精準表征。

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一、AOC的制造工藝

AOC制造通常涉及裸抗體、連接子、寡核苷酸、AOC散裝溶液和AOCs的生產(chǎn)。基于質量源于設計和風險評估等原則的工藝設計和開發(fā)，指導生產(chǎn)過程中宿主細胞、培養(yǎng)基和試劑的控制。應全面管理與AOC組件制造過程相關的潛在雜質和病毒污染風險。應在工藝開發(fā)層面進行優(yōu)化，以主動實現(xiàn)質量控制。

AOC生產(chǎn)材料包括制造材料、細胞基質、耗材和容器。制造材料涵蓋起始物料、生產(chǎn)過程中使用或添加的材料、輔料和生產(chǎn)耗材。制造材料的質量與最終產(chǎn)品的質量、安全性和有效性密切相關，應在穩(wěn)健和標準化的質量管理體系內使用風險評估原則進行控制。例如，當生產(chǎn)具有高疏水性的AOCs時，應特別注意AOC分子與滅菌濾膜之間潛在的非特異性結合，因此需要仔細選擇合適的膜。

1. 單克隆抗體

單克隆抗體通常用于AOCs，mAbs的制造工藝與傳統(tǒng)抗體治療藥物的制造非常相似。然而，由于為定點偶聯(lián)設計的基因工程mAbs的修飾基團，生產(chǎn)工藝可能有所不同。因此，除了常規(guī)抗體生產(chǎn)的風險因素外，還必須解決AOC制造特有的風險因素。例如，在采用賴氨酸介導綴合的AOCs中，應注意裸抗體上N末端賴氨酸殘基的水平以及裸抗體溶液中的氨基酸組成。在采用半胱氨酸介導偶聯(lián)的AOCs中，必須監(jiān)測裸抗體中的半胱氨酸變體，如具有二硫鍵和游離硫醇基團的半胱氨酸。在裸抗體溶液的開發(fā)過程中，應防止抗體降解和聚集。此外，與后續(xù)偶聯(lián)工藝的兼容性將防止在AOC生產(chǎn)的后期階段（包括綴合和制劑）產(chǎn)生不利影響。

典型的抗體生產(chǎn)過程包括細胞增殖、mAb表達、mAb純化以及mAb修飾和功能化。在細胞增殖和蛋白質表達過程中，應控制關鍵的細胞培養(yǎng)參數(shù)。親和層析通常用于mAbs的初步純化。低pH處理通常用于病毒滅活；但是，如果產(chǎn)品在低pH條件下不穩(wěn)定，則可以使用替代的病毒滅活策略。中間和精制純化通常采用離子交換層析和疏水相互作用層析。使用層析方法（包括混合填充材料的層析）從蛋白質中去除工藝相關和產(chǎn)品相關雜質。大多數(shù)純化工藝還結合了納濾以去除對化學滅活具有抵抗力的小病毒。最后，通過超濾濃縮mAbs并交換緩沖液。細胞培養(yǎng)和純化后，對抗體進行修飾以引入偶聯(lián)所需的官能團。修飾過程根據(jù)偶聯(lián)技術而異；主要目標是在抗體上引入反應性化學基團。例如，可以使用還原劑切割二硫鍵并生成反應性游離硫醇基團�？梢酝ㄟ^糖基的酶修飾引入反應性官能團。抗體修飾是決定AOCs中寡核苷酸負載能力和分布的關鍵步驟。因此，必須基于特定的偶聯(lián)技術和修飾開發(fā)合適的制造工藝，并建立合理的中間過程控制策略。如果需要純化修飾后的裸抗體，則應實施適當?shù)募兓に�。如果修飾過程中使用的試劑引入了外源性病毒污染物，則必須在純化過程中去除這些污染物。應根據(jù)國際人用藥品注冊技術協(xié)調會（ICH）Q5A指南進行病毒清除研究。如果將修飾后的裸抗體作為中間體管理，則必須建立質量標準，并且必須進行穩(wěn)定性研究以確定保質期。對于需要定點綴合的AOCs，mAb修飾過程中的還原和再氧化條件尤為關鍵。抗體修飾中的關鍵工藝參數(shù)包括試劑類型、接觸時間、試劑濃度和溫度。

2. 連接子

AOCs合成中采用兩種類型的連接子。含連接子的亞磷酰胺單體和含有兩個偶聯(lián)基團的連接子。含連接子的亞磷酰胺單體應根據(jù)適用于治療性寡核苷酸合成中用作起始物料的單體的控制標準進行開發(fā)和制造。含有兩個偶聯(lián)基團的連接子可以根據(jù)適用于常規(guī)小分子活性藥物成分的標準進行開發(fā)。應為連接子制造過程中使用的中間體、關鍵起始物料和試劑建立質量控制標準。當原材料或中間體中的雜質與最終產(chǎn)品的關鍵質量屬性相關時，必須驗證在制造過程中去除此類雜質或其衍生物。如果工藝涉及過濾器的重復使用，應注意過濾器的使用壽命和清潔方法，并進行相關研究。對于含有手性中心的連接子，應評估手性對AOC產(chǎn)品生物活性的影響，并適當控制手性雜質。連接子的關鍵質量屬性應通過基于其對AOC綴合工藝以及最終產(chǎn)品安全性和有效性的潛在影響的風險評估來確認。

3. 寡核苷酸

目前寡核苷酸活性藥物成分的工業(yè)生產(chǎn)采用以單體為原料的固相合成。合成過程在固相支持物上啟動，該支持物可能預裝載有遞送配體。使用固相合成設備，通過去保護、偶聯(lián)、氧化/硫代和加帽，將核苷單體依次連接到寡核苷酸鏈的3'至5'方向。通過氨解將寡核苷酸鏈從固相支持物上切割下來，并去除保護基團。隨后的純化、超濾和凍干（如適用）產(chǎn)生單鏈寡核苷酸中間體。然后將所得的正義鏈和反義鏈以適當?shù)谋壤嘶穑ㄈ邕m用）形成雙鏈寡核苷酸（如適用），隨后進行凍干（如適用）和包裝以獲得活性寡核苷酸藥物成分。

寡核苷酸的生產(chǎn)應根據(jù)ICH Q9-Q11中概述的原則進行評估，特別關注固相合成過程中每個步驟的關鍵性�；诠押塑账嶂圃旌唾|量控制的平臺賦能模塊的可用性，應根據(jù)先前項目的經(jīng)驗和歷史批次數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)的風險評估。應基于寡核苷酸活性藥物成分的質量目標產(chǎn)品概況，建立將關鍵質量屬性與關鍵工藝參數(shù)相關聯(lián)的風險管理策略，以制定適當?shù)闹圃旃に囐|量控制策略。高級控制策略可能包括過程分析技術（離線、在線、在線）、由設備內傳感器監(jiān)測的工藝參數(shù)直接通知的直接控制、生產(chǎn)線和設施中設備操作的實時控制以及數(shù)據(jù)管理和風險預測。

4. 含連接子的寡核苷酸

AOCs的有效載荷是低細胞毒性的寡核苷酸。因此，寡核苷酸的合成和制造可以在具有標準防護設備的常規(guī)生產(chǎn)設施中進行。通常不需要使用通風柜動力空氣凈化呼吸器、高活性材料隔離策略和環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測程序。連接子通常通過使用相容的連接子和亞磷酰胺單體進行一步固相合成摻入寡核苷酸中。如果所需連接子的化學性質與固相合成條件不兼容，則使用固相和液相合成以兩步法制備具有特定連接子的寡核苷酸。

5. AOC散裝溶液制備

使用各種技術平臺進行偶聯(lián)反應，通過快速化學或酶促反應將寡核苷酸精確附著到修飾裸抗體上的反應位點。在此過程中，必須考慮裸抗體、連接子和有效載荷物理化學性質的差異，并嚴格優(yōu)化關鍵工藝參數(shù)。有機溶劑的類型、小分子進料比例、pH、溫度和裸抗體濃度直接影響反應效率，必須精細控制以最小化聚集和非特異性結合的形成。

鑒于AOCs的高度異質性，工藝開發(fā)應關注以下方面：（1）如果涉及還原，則選擇抗體二硫鍵還原位點并控制還原程度；（2）偶聯(lián)位點的特異性以及對綴合寡核苷酸的精確控制；（3）有效載荷分布的均勻性；（4）監(jiān)測偶聯(lián)過程中的雜質。對于定點綴合，必須基于潛在機制評估脫靶綴合的風險和副反應的發(fā)生率。對于酶促偶聯(lián)，應驗證與酶相關的安全風險，特別是散裝溶液中的殘留水平。

擴大生產(chǎn)時需要特別注意兩個風險類別。首先，原材料投入過多可能導致副產(chǎn)物積累，需要進行風險評估，并結合下游純化能力進行工藝優(yōu)化。其次，必須通過逐步參數(shù)優(yōu)化和過程監(jiān)控來防止多步綴合反應中原材料比例不平衡或反應效率不足，例如偶聯(lián)未負載連接子的抗體比例增加、次優(yōu)OAR或殘留有效載荷過多。

偶聯(lián)后，應從AOC反應混合物中去除工藝相關和產(chǎn)品相關的雜質。工藝相關雜質包括殘留的修飾試劑（如還原劑）、催化劑、酶、有機溶劑和其他外源性物質。產(chǎn)品相關雜質包括聚集體、抗體片段、游離小分子及其衍生物、副產(chǎn)物和其他內源性污染物。值得注意的是，在AOC生產(chǎn)過程中，可以通過純化選擇性去除特定組分，以精細控制OAR和有效載荷分布。因此，純化技術的選擇應以特定的純化目標（例如雜質清除或產(chǎn)品屬性優(yōu)化）以及對生產(chǎn)過程中可能出現(xiàn)的雜質類型和水平的全面評估為指導。應建立有針對性的純化策略并驗證去除效率，以確保最終產(chǎn)品符合質量標準。

6. AOC制劑

AOC劑型和配方必須根據(jù)每個AOC的復雜性和獨特特性量身定制。應進行全面研究，以確定適當?shù)膭┬停乐笰OCs在儲存期間在溶液中降解和聚集。

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二、AOC的質量控制

AOCs具有抗體藥物和寡核苷酸治療藥物的屬性。鑒于AOC治療藥物獨特的分子結構和作用機制，在建立質量標準時應考慮整體AOC分子（散裝溶液和制劑）及其關鍵成分（裸抗體和寡核苷酸）。此外，質量控制策略應針對具體產(chǎn)品，并考慮設計原理和制造工藝。與ADCs類似，AOCs表現(xiàn)出復雜的結構、高異質性和多種多樣的產(chǎn)品相關和工藝相關雜質。應根據(jù)抗體和寡核苷酸的質量屬性以及與綴合工藝相關的因素來確定關鍵質量屬性。應開發(fā)適當?shù)募夹g和分析方法，以全面表征結構、物理化學性質、生物活性和雜質。對AOC中間體、散裝溶液和制劑的關鍵質量屬性的研究應基于以下章節(jié)提供的先前經(jīng)驗。

1. 中間體

AOCs中的寡核苷酸有效載荷大于ADCs中的小分子有效載荷，導致分子大小和電荷發(fā)生顯著變化。ADCs中偶聯(lián)分子的特性更像抗體而非小分子。然而，AOCs中的偶聯(lián)物表現(xiàn)出雙重特性，既像帶正電荷的抗體，又像帶負電荷的寡核苷酸。例如，ADC散裝溶液放行階段的質量控制屬性，如大小變異雜質、電荷變異雜質和糖基化變異雜質，在AOC散裝溶液放行階段控制起來要困難得多。這種復雜性也適用于寡核苷酸中的核酸雜質。寡核苷酸的產(chǎn)品相關雜質通常包括N-1和N+1序列變異；裸抗體的引入顯著復雜化了將這些雜質與AOCs分離的過程。因此，應在中間體放行階段單獨控制偶聯(lián)工藝之前產(chǎn)生的雜質。

裸抗體：評估用于AOCs的裸抗體中間體的質量類似于評估抗體藥物；但是，應考慮與偶聯(lián)工藝相關的質量屬性。例如，在采用半胱氨酸介導綴合的AOCs生產(chǎn)中，必須仔細監(jiān)測裸抗體中半胱氨酸變體（例如具有二硫鍵和游離硫醇基團的半胱氨酸）的水平。用于AOCs的裸抗體可能是新分子或生物類似藥，應具有明確的基因來源和背景信息。裸抗體生產(chǎn)細胞庫的表征和穩(wěn)定性評估必須符合《中華人民共和國藥典》和ICH Q5A。此外，培養(yǎng)基和添加劑不應存在傳染性海綿狀腦病或牛海綿狀腦病的風險�？傮w而言，可能影響最終產(chǎn)品安全性和有效性的質量屬性應根據(jù)產(chǎn)品特有的特性進行適當控制。工藝相關雜質，包括宿主細胞DNA和蛋白質，應在中間體放行階段控制，而不是在AOC散裝溶液放行階段。

寡核苷酸和含連接子的寡核苷酸：寡核苷酸生產(chǎn)通常采用固相合成。ICH Q6A明確指出，其范圍不包括放射性藥物、發(fā)酵產(chǎn)品、寡核苷酸、草藥或源自動物和植物的粗制品，或寡核苷酸治療藥物。但是，一些測試項目和限度仍可使用本指南作為補充參考進行開發(fā)，包括外觀、鑒別、含量測定和雜質。此外，美國食品藥品監(jiān)督管理局和歐洲藥品管理局最近發(fā)布的寡核苷酸藥物草案指南也可作為參考。

除了小分子化學藥物或合成肽活性藥物成分的標準質量評估外，固相合成寡核苷酸藥物的質量評估應納入針對其獨特制造工藝、結構特征和物理化學性質的具體測試，包括序列驗證和反離子含量分析。寡核苷酸中的產(chǎn)品相關雜質多樣且結構復雜（例如N-1、N+1、不完全去保護和P=O），需要多種正交分析方法來控制。工藝相關雜質，包括殘留試劑和小分子污染物，通常在寡核苷酸制造過程中完全去除。此外，遺傳毒性雜質、殘留溶劑和無機雜質的控制策略應與相關ICH指南保持一致。

含連接子的寡核苷酸的質量控制取決于合成路線，可分為兩種情況。如果連接子是通過固相合成過程中使用專門的亞磷酰胺單體引入的，則可以使用標準寡核苷酸質量控制策略評估含連接子的中間體寡核苷酸。但是，如果連接子是通過與寡核苷酸中間體反應引入的，則應評估寡核苷酸和連接子偶聯(lián)的寡核苷酸中間體。應評估含連接子的寡核苷酸在偶聯(lián)過程中引入的雜質或反應副產(chǎn)物。例如，用馬來酰亞胺基團修飾的寡核苷酸通常會發(fā)生緩慢水解，導致產(chǎn)生非反應性寡核苷酸-連接子副產(chǎn)物。此外，應控制在寡核苷酸-連接子偶聯(lián)反應中使用的溶劑等工藝相關雜質。

與ASOs和PMOs不同，siRNA作為雙鏈寡核苷酸，需要確保siRNA在寡核苷酸連接子偶聯(lián)步驟和抗體綴合物制備步驟中的穩(wěn)定性。通常，siRNA連接子的制備在抗體偶聯(lián)物制備之前完成。策略1涉及首先制備寡核苷酸連接子偶聯(lián)物，然后與互補鏈雜交。策略2涉及首先制備連接子siRNA的雜交，然后將連接子與帶有連接子的siRNA偶聯(lián)。無論采用何種策略，都需要確保siRNA在工藝步驟中的穩(wěn)定性，并避免在高溫和高pH下變性。對于siRNA純度的檢測，可以使用尺寸排阻色譜法和非變性離子對反相色譜法來控制雙鏈和殘留單鏈的純度。應過量使用不含連接子的互補鏈，因為它不會在抗體綴合物制備步驟中引入AOC儲備溶液，并且在工藝步驟中更容易去除。此外，對于偶聯(lián)過程中產(chǎn)生的寡核苷酸或寡核苷酸-連接子降解產(chǎn)物，例如由馬來酰亞胺水解形成的非反應性連接子-寡核苷酸雜質和反應性寡核苷酸脫硫雜質，一個可用的選擇是使用反相色譜法，它提供增強的分辨率、變性離子對或變性離子交換色譜法。

2. AOC散裝溶液

寡核苷酸-抗體比率（OAR）‍：OAR定義為每個抗體分子綴合的寡核苷酸分子數(shù)。OAR決定了AOC的分子量和大小，并與AOC的物理化學性質密切相關，包括溶解度、親和力和聚集。OAR直接影響產(chǎn)品的效力、安全性和藥代動力學。因此，優(yōu)化OAR可顯著提高成本效益和制造效率。OAR必須在散裝溶液制造過程中進行控制和監(jiān)測，尤其是在偶聯(lián)過程中。用于OAR的常見分析方法包括紫外-可見光譜法、強陰離子交換色譜法、毛細管區(qū)帶電泳-質譜法、還原毛細管凝膠電泳法和尺寸排阻色譜-質譜法。ADCs的藥物-抗體比率分析通常利用不同數(shù)量小分子有效載荷的疏水性差異。然而，對于AOCs，寡核苷酸的變化導致疏水性和與色譜固定相的二次相互作用差異最小。因此，使用疏水相互作用色譜法或反相液相色譜法分析AOCs的OAR具有挑戰(zhàn)性。帶負電荷的寡核苷酸通常會改變AOC分子的整體電荷。因此，可以采用能夠區(qū)分電荷差異的分析方法來分析具有不同OAR的AOCs。Tian等人首次使用毛細管區(qū)帶電泳-質譜法來表征和量化具有不同OAR值的AOCs。優(yōu)化鞘流緩沖液和干燥氣體條件顯著提高了AOCs的電離和解吸效率，并通過調節(jié)背景電解質的pH實現(xiàn)了具有不同OAR的AOCs的分離。Cochran等人使用還原毛細管凝膠電泳分析了抗體綴合PMOs的OAR。使用還原毛細管凝膠電泳可以分離還原的輕鏈、綴合一個PMO的輕鏈、重鏈和綴合一個至五個PMO的重鏈，顯著提高了OAR測定的準確性。此外，通過尺寸排阻色譜結合質譜分析AOCs中的OAR值與ADCs相比具有明顯優(yōu)勢。ADCs中的藥物分子通常分子量低于2 kDa。然而，寡核苷酸要大得多，通常超過10 kDa。因此，具有不同OAR值的AOCs之間的分子量差異非常明顯。利用這一優(yōu)勢，Nagornov等人采用天然尺寸排阻色譜結合Orbitrap傅里葉變換質譜法分析了曲妥珠單抗-寡核苷酸偶聯(lián)物的完整分子和亞基的OAR分布，并計算了平均OAR。將FTMS Booster X2數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)與Q Exactive HF Orbitrap儀器用于傅里葉變換質譜，實現(xiàn)了簡化的數(shù)據(jù)采集和處理。因此，在OAR分析之前不再需要純化和去糖基化步驟，簡化了藥物開發(fā)流程。值得注意的是，基于質譜的方法往往會低估OAR，因為寡核苷酸的負電荷會顯著降低正離子模式下高OAR分子的信號。因此，應使用正交技術（如強陰離子交換高效液相色譜法）補充基于質譜的OAR測定。

偶聯(lián)位點分布和未偶聯(lián)mAbs：AOCs的異質性反映在偶聯(lián)寡核苷酸數(shù)量的變化和偶聯(lián)的特定位點上，這會影響其效力和安全性。當前的AOC偶聯(lián)策略，不包括離子相互作用和競爭性親和力（例如生物素標記的寡核苷酸與抗體上親和素之間的強相互作用），通常涉及通過賴氨酸或半胱氨酸殘基進行化學偶聯(lián)，從而導致產(chǎn)品異質性。應采用適當?shù)姆治龇椒�，包括離子交換色譜法、尺寸排阻色譜法、毛細管電泳法和質譜法，來表征具有不同OAR的AOCs上的寡核苷酸分布。蛋白質工程和酶方法已成功應用于生產(chǎn)具有改善均一性和定點AOCs，這可能會減少綴合位點異質性帶來的挑戰(zhàn)。

以ADCs為例，液相色譜-質譜法是分析綴合位點的行業(yè)標準，因其高靈敏度、高分辨率和位點特異性分析。然而，使用這種方法分析AOCs中的偶聯(lián)位點具有挑戰(zhàn)性。寡核苷酸相對較大的分子量和負電荷會顯著改變抗體的電荷，并可能主導AOC的凈電荷。這些差異影響了檢測模式（正離子或負離子模式）的選擇，并增加了串聯(lián)質譜中離子碎裂的難度，阻礙了偶聯(lián)位點的準確識別。為了應對這些挑戰(zhàn)，應引入樣品制備步驟，去除寡核苷酸部分，以提高偶聯(lián)水平的定量準確性和離子碎裂質量。去除寡核苷酸部分的常用方法包括酶消化（例如使用核酸酶P1或磷酸二酯酶I）將寡核苷酸消化成短核苷酸序列甚至單個核苷酸。酶消化對天然寡核苷酸和化學修飾的寡核苷酸都有效。該策略已成功應用于ADCs中偶聯(lián)位點的識別和定量，顯著提高了綴合位點的識別率和綴合水平的定量準確性。

對于非偶聯(lián)抗體，使用強陰離子交換色譜法或尺寸排阻色譜法進行質量控制。在強陰離子交換中，通過帶負電荷的分析物與固定相中帶正電荷的季銨基團之間的靜電相互作用實現(xiàn)保留。保留強度由目標分子上的負電荷決定。典型的洗脫順序如下：非偶聯(lián)抗體、具有不同OAR的AOCs（較高OAR洗脫較晚）和游離寡核苷酸。大多數(shù)非偶聯(lián)抗體不攜帶負電荷。因此，它們傾向于不保留地流過，與其他組分（如AOCs）分離。然而，確保反應溶液和儲存緩沖液在檢測波長處沒有特征吸收至關重要，因為這可能導致高估。值得注意的是，強陰離子交換色譜法不適用于中性電荷的寡核苷酸有效載荷（如PMOs）；因此，應采用替代分析方法來分析這些有效載荷�；诔叽缗抛枭V的分離機制，洗脫順序通常如下：具有不同OAR的AOCs（較高OAR洗脫較早）、非偶聯(lián)抗體和游離寡核苷酸。尺寸排阻色譜法也可用于檢測分子量與其他組分顯著不同的非偶聯(lián)抗體。偶聯(lián)位點分布和非偶聯(lián)mAbs的分析可以與OAR相關聯(lián)，以提高產(chǎn)品質量控制的全面性。

生物活性：生物活性是產(chǎn)品質量和效力的關鍵指標。對于AOCs，應建立生物活性測定以反映體內藥效學機制。這些測定是評估產(chǎn)品功能活性的基礎。AOCs中的抗體與靶抗原結合，隨后AOC-受體復合物內在化形成內體。連接子的裂解促進寡核苷酸從內體釋放到細胞質中，在那里發(fā)揮其生物效應。應采用適當?shù)姆治龇椒�，包括表面等離子體共振和酶聯(lián)免疫吸附測定，來評估AOC與靶抗原的結合。應開發(fā)使用表達靶抗原的細胞系的基于細胞的測定來分析生物活性�？梢愿鶕�(jù)評估靶細胞中小核酸藥物效力的方法來評估AOC治療藥物的體外效力。應評估靶mRNAs、蛋白質、細胞表型和功能干擾。在選擇生物活性測定時，應優(yōu)先考慮變異性低、操作簡單、可有效評估和質量控制的測定。

游離寡核苷酸：未與抗體偶聯(lián)的寡核苷酸以多種形式存在，包括游離寡核苷酸和寡核苷酸-連接子復合物。游離寡核苷酸的毒性源于由于堿基互補配對而產(chǎn)生的雜交依賴性毒性；與雜交無關的毒性與其化學修飾、物理化學性質和遞送載體有關。這些毒性可能導致血小板減少癥、凝血抑制以及高暴露水平器官的毒性作用�？梢酝ㄟ^基于其毒性和清除率建立適當?shù)南薅葋砜刂朴坞x寡核苷酸。此外，在穩(wěn)定性研究期間，應注意有效載荷脫落的風險，這可以通過使用強陰離子交換色譜法和尺寸排阻色譜法監(jiān)測AOC產(chǎn)品中游離寡核苷酸的水平來評估。

其他關鍵質量屬性：

AOC和蛋白質濃度：應采用適當?shù)奈锢�、化學或免疫學方法來量化AOC產(chǎn)品。當使用分光光度法進行濃度測量時，必須考慮寡核苷酸在測量波長處對吸光度的潛在貢獻。寡核苷酸在260 nm處表現(xiàn)出最大吸收，在計算AOC散裝溶液或制劑的濃度時通常需要適當?shù)男Ｕ蜃�。Cochran等人使用280 nm處的吸光度和藥物-抗體比率1和2的消光系數(shù)確定了AOC濃度。蛋白質濃度也可以使用BCA測定等方法測量。評估裸抗體中間體、散裝溶液和制劑的蛋白質含量，以確保產(chǎn)品穩(wěn)定性和效率。

產(chǎn)品相關雜質：AOC散裝溶液中的產(chǎn)品相關雜質包括由物理化學異質性產(chǎn)生的分子變異。應分離、識別和分析目標產(chǎn)物的分子變異。常見的產(chǎn)品相關雜質包括電荷變異、分子大小變異和降解產(chǎn)物。例如，在使用馬來酰亞胺試劑修飾抗體期間，可能通過與鄰近賴氨酸殘基的反應形成非特異性分子內交聯(lián)副產(chǎn)物。表現(xiàn)出與目標產(chǎn)品等效活性的變異包括產(chǎn)品相關物質。

對于在散裝溶液生產(chǎn)或儲存過程中由AOC降解產(chǎn)生的裸抗體或寡核苷酸雜質，應利用適當?shù)念A處理策略來最小化或消除分析此類雜質相關的挑戰(zhàn)。例如，可以對AOC進行蛋白水解消化以分析siRNA或ASO，并應用寡核苷酸的磷酸二酯酶消化來分析抗體。這些策略涉及可能對產(chǎn)品質量分析構成風險的樣品預處理步驟。因此，必須系統(tǒng)評估預處理對產(chǎn)品的影響，以避免將預處理引入的雜質誤判為產(chǎn)品相關雜質或高估其水平。

工藝相關雜質：工藝相關雜質是在制造過程中引入的，包括由抗體和連接子綴合的寡核苷酸之間反應產(chǎn)生的雜質。這些雜質包括酶、有機試劑和元素雜質。應對這些雜質的殘留水平進行徹底的安全風險評估，并應將具有潛在安全風險的殘留雜質納入質量控制標準。

3. 成品AOC產(chǎn)品

對于成品AOC產(chǎn)品的質量控制，應遵循藥典標準，同時考慮具體產(chǎn)品類型和劑型�？刂茀�(shù)通常包括外觀、pH、滲透壓、可見異物、不溶性微粒、灌裝體積和輔料含量。對于凍干形式，應控制復溶時間和水分含量。值得注意的是，化學修飾的寡核苷酸在儲存過程中可能產(chǎn)生內源性可見顆粒。此外，抗體和寡核苷酸可以形成非共價復合物作為副產(chǎn)物，可能會沉淀。這些風險應在AOC制劑開發(fā)過程中仔細考慮，并實施主動監(jiān)測策略。此外，應評估源自起始物料、散裝溶液、中間體以及與產(chǎn)品接觸的材料或設備的可提取物的風險。檢測到的可提取物應根據(jù)ICH Q3E進行安全評估，以防止對產(chǎn)品安全產(chǎn)生任何不利影響。

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結語

總而言之，AOCs的制造與質量控制是一個多學科交叉的復雜系統(tǒng)工程。從抗體的工程化改造、連接子的理性設計、寡核苷酸的化學合成，到最終的偶聯(lián)、純化及制劑，每一步都需要精細的工藝優(yōu)化和嚴格的過程監(jiān)控。建立穩(wěn)健、可放大的生產(chǎn)工藝，并輔以能夠全面表征其復雜結構和功能的質量控制方法，是AOC藥物成功實現(xiàn)臨床轉化和商業(yè)化生產(chǎn)的基石。隨著行業(yè)經(jīng)驗的積累和監(jiān)管科學的進步，標準化的AOC生產(chǎn)與質控指南將應運而生，進一步推動這一新興治療平臺的發(fā)展。

參考文獻：

Advances in the pharmaceutical development of antibody-oligonucleotide conjugates.

Eur J Pharm Sci. 2025 Dec 1:215:107292.

原文標題 : AOC的工藝制造與質量控制