β-甘露聚糖酶在植物乳桿菌中的組成型表達(dá)與表面展示

2019-11-01 09:08

文章背景簡(jiǎn)介

BACKGROUND INTRODUCTION

甘露聚糖酶能隨機(jī)催化水解含有β－1，4甘露糖苷鍵的β－1，4甘露聚糖、葡甘露聚糖及半乳甘露聚糖生成甘露寡糖。已有研究證明，甘露寡糖對(duì)人和家畜的健康具有促進(jìn)作用。

研究表明，甘露聚糖酶能夠利用誘導(dǎo)型表達(dá)載體pSIP在植物乳桿菌中有效的生產(chǎn)和表達(dá)。但是在進(jìn)行游離酶的分離純化時(shí)酶容易被破壞。此外，蛋白質(zhì)的化學(xué)固定化也是一個(gè)費(fèi)力并且有害的過(guò)程，存在一些缺點(diǎn)，如酶活性的回收率低，在反應(yīng)過(guò)程中酶活逐漸喪失、一些固定化酶與底物之間傳質(zhì)阻力大……等等。因此，在所謂的基因固定化中，利用細(xì)菌作為固定化基質(zhì)，合成與錨定基序融合的蛋白質(zhì)，然后將其錨定在細(xì)菌細(xì)胞表面，很容易從培養(yǎng)中獲得固定化酶。這種方法通過(guò)讓細(xì)胞完成整個(gè)過(guò)程，實(shí)際上克服了游離酶或傳統(tǒng)固定的許多限制。此外，表面展示酶在惡劣條件下具有很高的耐受性或穩(wěn)定性，特別是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)嵌入細(xì)菌細(xì)胞壁時(shí)，可以在多個(gè)工藝循環(huán)中重復(fù)使用。

深入了解不同錨定基序的作用機(jī)制，將對(duì)乳酸菌細(xì)胞表面系統(tǒng)的研究和開(kāi)發(fā)具有食品和生物技術(shù)應(yīng)用價(jià)值的酶的固定化具有重要意義。原則上，一種外源蛋白主要可以通過(guò)兩種策略附著到乳酸菌細(xì)胞的包膜上，一是采用錨定脂蛋白或利用sortase酶途徑與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁以共價(jià)鍵附著在一起。另外則可以采用一個(gè)蛋白質(zhì)域以非共價(jià)的方式與細(xì)胞壁或膜的成分形成強(qiáng)烈相互作用。

針對(duì)與食品相關(guān)的應(yīng)用，使用可誘導(dǎo)的乳酸菌表達(dá)載體（需要在培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加合成誘導(dǎo)劑）可能不是首選。此外，誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)不適合在與人體內(nèi)進(jìn)行治療，也不適合應(yīng)用于酶制劑的原位生產(chǎn)中。因此，使用組成型表達(dá)載體生產(chǎn)蛋白質(zhì)將是一種不錯(cuò)的選擇。

越南峴港大學(xué)生物技術(shù)系的Nguyen等人2019年在《Microbial Cell Factories》雜志上（IF 2018＝4．402，生物工程與應(yīng)用微生物2區(qū)）發(fā)表了題為“Constitutive expression and cell－surface display of a bacterial β－mannanase in Lactobacillus plantarum”的文章。在該研究中，作者研究了兩個(gè)組成型啟動(dòng)子：來(lái)自嗜酸乳桿菌NCFM的Pgm啟動(dòng)子和嗜酸乳桿菌ATCC4356的SlpA啟動(dòng)子，隨后利用這兩個(gè)啟動(dòng)子在植物乳桿菌WCFS1中表達(dá)含有脂錨定蛋白Lp＿1261的β－甘露聚糖酶。這些組成型啟動(dòng)子被證明是乳酸桿菌胞內(nèi)產(chǎn)生外源蛋白的強(qiáng)啟動(dòng)子，但是利用這些啟動(dòng)子在細(xì)胞外表達(dá)和在細(xì)菌細(xì)胞表面顯示外源蛋白的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，對(duì)這些活性甘露聚糖酶表面展示的組成型啟動(dòng)子的功能進(jìn)行評(píng)估，可能為開(kāi)發(fā)安全的、食品級(jí)的全細(xì)胞生物催化劑鋪平道路，這些催化劑可用于生產(chǎn)促進(jìn)健康的低聚糖。

所用到的主要方法

METHODS

（1）質(zhì)粒構(gòu)建

（2）凝膠電泳和Westernblotting

（3）流式細(xì)胞術(shù)和間接免疫熒光顯微鏡分析

（4）薄層色譜

（5）高效陰離子交換色譜（HPAEC）

文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

由于乳酸菌的食品級(jí)地位和益生菌的特性，一些乳酸菌被認(rèn)為是安全有效的細(xì)胞工廠。本研究旨在對(duì)地衣芽孢桿菌DSM13的一種甘露聚糖酶進(jìn)行組成型表達(dá)，該酶隨后被展示在植物乳桿菌的細(xì)胞表面，用于寡糖生產(chǎn)的全細(xì)胞生物催化劑。來(lái)自嗜酸乳桿菌NCFM和嗜酸乳桿菌ATCC4356的兩個(gè)強(qiáng)組成性啟動(dòng)子，Pgm和SlpA，分別取代乳酸桿菌pSIP表達(dá)系統(tǒng)中的誘導(dǎo)啟動(dòng)子進(jìn)行載體構(gòu)建。作者將甘露聚糖酶編碼基因（manB）與植物乳桿菌N端脂錨定蛋白（Lp＿1261）融合并克隆到組成型pSIP載體中，在植物乳桿菌WCFS1中進(jìn)行了表達(dá)。然后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光顯微術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)該蛋白在細(xì)菌細(xì)胞表面的定位，并對(duì)構(gòu)建的植物乳桿菌細(xì)胞表面甘露聚糖酶活性和重復(fù)利用度進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示：在Pgm和SlpA啟動(dòng)子的控制下，植物乳桿菌細(xì)胞表面獲得的甘露聚糖酶活性最高，分別為1200 U／g和3500 U／g干細(xì)胞重量，分別比誘導(dǎo)的pSIP錨定載體所獲得的活性高2．6倍和7．8倍。表面展示的甘露聚糖酶能夠?qū)肴楦事毒厶墙到獬筛事豆烟恰１狙芯渴褂玫姆椒ǎ脧?qiáng)大的組成型啟動(dòng)子，使一種β－甘露聚糖酶在植物乳桿菌細(xì)胞表面實(shí)現(xiàn)了組成型表達(dá)和表面展示，這將有助于實(shí)現(xiàn)重組蛋白在無(wú)需添加誘導(dǎo)劑或改變宿主菌株生長(zhǎng)條件下進(jìn)行持續(xù)地合成。