液體PTVA：一種在畢赤酵母中生成多拷貝克隆的高效、低成本新方法

2019-09-06 09:17

文章背景簡(jiǎn)介

BACKGROUND INTRODUCTION

畢赤酵母常用于表達(dá)外源蛋白，是一個(gè)理想的細(xì)胞工廠，因?yàn)樗軌蜻_(dá)到非常高的細(xì)胞密度，并將蛋白質(zhì)分泌到上清液中，并且畢赤酵母本身分泌的天然蛋白質(zhì)較少，簡(jiǎn)化了下游純化的工藝。增加同源基因的拷貝數(shù)量可以使外源蛋白的產(chǎn)量增加。然而，由于蛋白在分泌途徑中會(huì)達(dá)到飽和，多拷貝克隆和外源蛋白表達(dá)兩者之間的關(guān)系并不是線性的。因此，研究中需要測(cè)定具有不同拷貝數(shù)的菌株，以確定蛋白表達(dá)量最大的菌株。因此，需要一種快速、簡(jiǎn)便的方法來(lái)產(chǎn)生具有一定基因拷貝數(shù)的菌株。

目前，產(chǎn)生多拷貝克隆的實(shí)驗(yàn)方法有幾種，包括轉(zhuǎn)化前載體的體外多克隆、利用高濃度抗生素直接篩選轉(zhuǎn)化子等。采用直接選擇法，在含有較高濃度抗生素的平板上產(chǎn)生的菌落數(shù)量往往大大減少，從而會(huì)限制獲得的多拷貝菌株的數(shù)量。由于直接選擇法生成多拷貝克隆的效率較低，2008年Sunga等人提出了轉(zhuǎn)化后矢量放大的方法（PTVA）。在PTVA中，細(xì)胞不是在平板上直接使用高濃度的抗生素來(lái)篩選，而是隨著抗生素濃度的增加來(lái)進(jìn)行篩選，隨著細(xì)胞抗生素耐藥基因的拷貝數(shù)增加，使細(xì)胞適應(yīng)更高的抗生素濃度。

PTVA已被廣泛應(yīng)用于畢赤酵母，然而，盡管PTVA比較容易操作，但該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。2016年2月5日，倫敦帝國(guó)學(xué)院（Imperial College London）的Rochelle Aw 和Karen M． Polizzi等人，在《Microbial Cell Factories》雜志（當(dāng)前IF4．402；工程技術(shù)2區(qū)）發(fā)表了題為“Liquid PTVA： a faster and cheaper alternative for generating multi－copy clones in Pichia pastoris”的文章，描述了一種通過(guò)在液體介質(zhì)中連續(xù)傳遞來(lái)減少PTVA時(shí)間和成本的方法，這種方法能夠很好的獲得包含不同拷貝數(shù)的菌株。

所用到的主要方法

METHODS

1．轉(zhuǎn)換后矢量放大技術(shù)（PTVA）

轉(zhuǎn)換后矢量放大技術(shù)（PTVA）是指細(xì)胞不是直接通過(guò)高濃度的抗生素來(lái)進(jìn)行篩選，而是隨著抗生素濃度的增加來(lái)篩選多拷貝的一種方法。在篩選的初級(jí)階段，抗生素耐藥基因的拷貝數(shù)增加，使細(xì)胞適應(yīng)更高的抗生素濃度。因此，在較高的抗生素濃度下存活的菌株也含有較高數(shù)量目的基因的完整副本。

2．Q－PCR

3．分光光度法

4．載體構(gòu)建

文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

背景：為了提高畢赤酵母重組蛋白表達(dá)的產(chǎn)量，研究人員經(jīng)常使用多個(gè)同源基因拷貝克隆的方法。轉(zhuǎn)化后矢量放大技術(shù)（PTVA）可以有效地在畢赤酵母中生成多拷貝克隆。然而，盡管這種方法相對(duì)容易操作、成功率較高，但是這個(gè)過(guò)程時(shí)間周期比較長(zhǎng)，與此同時(shí)也會(huì)花費(fèi)較多的金錢。

結(jié)果：本文開發(fā)了一種改良版的PTVA，稱為液體PTVA，這種方法克服了傳統(tǒng)PTVA（在固體培養(yǎng)皿篩選）的缺點(diǎn)，能夠更快、更便宜地選擇多拷貝克隆。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞是在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的，只是最后的篩選是在瓊脂平板上進(jìn)行的。這種方法不僅減少了抗生素總體的使用情況，而且提高了克隆擴(kuò)增的速度。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)：以單一拷貝的菌株來(lái)進(jìn)行篩選可使兩種PTVA（傳統(tǒng)平板篩選和液體篩選）產(chǎn)生更高的拷貝數(shù)菌株。另外，在液體PTVA中使用Zeocin作為篩選抗生素，可以獲得生長(zhǎng)速度較高的菌株。

結(jié)論：本文創(chuàng)建了一種多拷貝克隆方法——液體PTVA，這種方法可以在12天內(nèi)完成，而不是傳統(tǒng)的45天，而且花費(fèi)的成本大約只有先前方法的一半。