新型雙功能褐藻膠裂解酶構(gòu)效關(guān)系分析及在褐藻寡糖制備中的應(yīng)用

2019-04-29 08:34

文章背景簡介

BACKGROUND INTRODUCTION

褐藻膠是海帶等褐藻細(xì)胞壁的主要成分，它是一種由β－D－甘露糖醛酸（M）及α－L－古爾糖醛酸（G）組成的線性多糖。它由三種不同的單元組成，即聚β－d－甘露糖醛酸（polyM）、聚α－l－古龍?zhí)侨┧幔╬olyG）和雜聚物（polyMG）。海藻酸鈉具有良好的化學(xué)性質(zhì)和多種活性，且來源豐富、成本低廉，在食品和醫(yī)藥工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。但由于分子量大、生物利用度低，褐藻酸鹽的應(yīng)用受到很大限制。近年來，褐藻膠的降解產(chǎn)物褐藻寡糖由于具有抗氧化、抗凝血、抗腫瘤的生物活性和良好的溶解性，受到越來越多的關(guān)注。

褐藻膠裂解酶是廣泛存在于海洋微生物、土壤微生物、噬菌體、病毒及海洋軟體動(dòng)物體內(nèi)的一種可通過β－消除作用將褐藻膠降解為不飽和寡糖的酶類。根據(jù)蛋白質(zhì)序列相似性，褐藻膠裂解酶被分在PL－5、6、7、14、15、17和18家族。根據(jù)其底物特性，海藻酸鈉裂合酶可分為G區(qū)特異性裂合酶（polyG裂解酶）和M區(qū)特異性裂合酶（polyM裂解酶）。而根據(jù)作用方式，則可分為內(nèi)溶型和外溶型。內(nèi)溶型可以識(shí)別并裂解糖苷鍵將褐藻膠分解成二糖、三糖、四糖等不飽和低聚糖，而外溶型則可以進(jìn)一步將低聚糖降解為單體。

2019年，南京工業(yè)大學(xué)Zhu B等人在《Biotechnology for Biofuels》（IF＝5．497，工程技術(shù)1區(qū)）上發(fā)表了題為“Elucidation of degrading pattern and substrate recognition of a novel bifunctional alginate lyase from Flammeovirga sp． NJ－04 and its use for preparation alginate oligosaccharides”的文章。Flammeovirga sp．NJ－04是一種從深海中分離出的可以降解褐藻酸鹽的菌株，研究已發(fā)現(xiàn)其中含有可以降解褐藻酸鹽的基因簇。該研究從這一菌株中克隆鑒定了一種新的PL7家族雙功能褐藻膠裂解酶FsAlgB。與PL7家族的大多數(shù)褐藻膠裂解酶一樣，它能以內(nèi)溶方式將褐藻酸降解為低聚糖。據(jù)報(bào)道，PL7家族中鞘氨醇單胞菌的A1－II′表現(xiàn)為β－夾心果凍卷折疊（β－sandwich jelly roll－fold）結(jié)構(gòu)，它可以與四糖底物結(jié)合水解成二糖和三糖。與四糖結(jié)合的A1－II′結(jié)構(gòu)表明，Gln189和Arg146是底物羧基的中和劑，此外還有作為廣義堿的His191以及作為廣義酸的Tyr284。然而，目前PL7家族酶的底物降解模式尚不清楚。本文對(duì)FsAlgB的降解方式、生化特性、作用方式及產(chǎn)物特征進(jìn)行了分析研究。

所用到的主要方法

METHODS

1．質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)

2．HiTrapTM脫鹽

3．SDS－PAGE

4．紫外吸收法測(cè)酶活

5．ESI－MS

6．TLC薄層色譜

7．分子模型及對(duì)接分析

文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

背景：褐藻寡糖是一種具有抗氧化、抗凝血、抗腫瘤等多種生理功能的低聚糖，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和食品工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。雙功能海藻酸裂合酶能更有效地將褐藻酸多糖降解為褐藻寡糖。因此，尋找新的雙功能褐藻酸裂合酶是生產(chǎn)褐藻寡糖的關(guān)鍵。

結(jié)果：本文從深海細(xì)菌Flammeovirga sp．NJ－04中克隆并鑒定出了一種新的雙功能褐藻酸裂合酶FsAlgB，其在pH8．0和40℃下具有廣泛的底物特異性及高活性（1760．8U／mg）。并且，F(xiàn)sAlgB對(duì)polyG（0．69mM）和polyMG（0．92mM）的Km值低于對(duì)海藻酸鈉（1．28mM）和polym（2．06mM）的Km值。重組表達(dá)FsAlgB后，進(jìn)一步鑒定其為一種內(nèi)溶性褐藻膠裂解酶，它可以識(shí)別的最小底物為四糖，并能裂解其？3到＋1亞基之間的糖苷鍵。

結(jié)論：本研究為具有廣泛底物特異性的海藻酸鈉裂合酶的底物識(shí)別和降解模式提供了更深入的見解。