嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞的殺傷機(jī)制

2026-05-21 16:01

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引言

有效的過繼性T細(xì)胞療法（ACT）包括通過治療性使用轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞來殺傷癌細(xì)胞。主要的ACT方法之一是嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞療法。CAR T細(xì)胞通過使T細(xì)胞能夠通過單鏈可變片段（scFv）識(shí)別域結(jié)合靶細(xì)胞表面抗原，介導(dǎo)MHC非限制性的腫瘤細(xì)胞殺傷。結(jié)合后，CAR T細(xì)胞形成非經(jīng)典的免疫突觸（IS），這是其效應(yīng)功能所必需的。這些細(xì)胞隨后通過穿孔素和顆粒酶軸、Fas和Fas配體軸，以及釋放細(xì)胞因子以敏化腫瘤基質(zhì)，來介導(dǎo)其抗腫瘤效應(yīng)。它們?cè)谒拗黧w內(nèi)的持久性和功能輸出嚴(yán)格依賴于受體各個(gè)組件——scFv、間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域和共刺激結(jié)構(gòu)域——以及這些組件的功能如何協(xié)同作用以增強(qiáng)CAR T細(xì)胞的性能。

CAR是一種合成結(jié)構(gòu)，可以通過單鏈可變片段（scFv）識(shí)別域結(jié)合靶細(xì)胞表面抗原。最初的概念將這個(gè)配體識(shí)別域與一個(gè)由CD3ζ鏈的一部分組成的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)模塊連接起來，以在抗原結(jié)合后誘導(dǎo)T細(xì)胞激活。這兩個(gè)模塊通過一個(gè)細(xì)胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域和一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域連接，形成了最簡(jiǎn)單的CAR形式，被稱為第一代CAR。TCR CD3ζ鏈包含3個(gè)免疫酪氨酸激活基序（ITAMs），因此，即使沒有TCR-CD3復(fù)合物的其他組分（γ、δ和ε鏈），該鏈本身也能傳遞強(qiáng)大的信號(hào)。信號(hào)由淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶（Lck）介導(dǎo)的CD3胞質(zhì)域內(nèi)ITAMs的磷酸化啟動(dòng)。

后續(xù)改進(jìn)現(xiàn)有CAR分子的努力導(dǎo)致了第二代和第三代CAR結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，這些結(jié)構(gòu)整合了信號(hào)內(nèi)結(jié)構(gòu)域，如CD28、CD137（也稱為4-1BB）和誘導(dǎo)性T細(xì)胞共刺激因子（ICOS），試圖模擬抗原呈遞細(xì)胞（APCs）在TCR識(shí)別期間提供的共刺激。這種由磷酸肌醇3-激酶PI3K（在CD28的情況下）傳播的共刺激信號(hào)，對(duì)于完全的生理性T細(xì)胞激活是必需的。向第四代或第五代CAR T細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)展包括了來自細(xì)胞因子受體的信號(hào)結(jié)構(gòu)域或炎癥細(xì)胞因子（如IL-12或IL-18）的可誘導(dǎo)表達(dá)。

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一、非經(jīng)典免疫突觸形成

傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTLs）由于其TCR結(jié)合后形成獨(dú)特的免疫學(xué)突觸，能夠迅速破壞并消除其靶細(xì)胞。這種高度有組織的結(jié)構(gòu)由一系列同心環(huán)，即超分子激活簇（SMAC）組成，每個(gè)環(huán)源自賦予特定功能的聚集分子。中央SMAC（cSMAC）由TCR和Lck簇組成，通過積累T細(xì)胞激活信號(hào)和遞送細(xì)胞毒性顆粒來增強(qiáng)和放大致死反應(yīng)。它被外周SMAC（pSMAC）包圍，pSMAC是淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（LFA-1）粘附分子的一個(gè)環(huán)，可穩(wěn)定IS和靶細(xì)胞結(jié)合。遠(yuǎn)端SMAC（dSMAC）是肌動(dòng)蛋白的聚集，完成了IS的靶心結(jié)構(gòu)。

已知CAR T細(xì)胞至少部分利用常規(guī)的TCR信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。因此，人們可能認(rèn)為CAR T細(xì)胞-靶細(xì)胞IS與經(jīng)典的相似。然而，研究揭示了CAR形成的IS結(jié)構(gòu)與經(jīng)典TCR IS相比存在顯著差異。雖然證明了LFA-1對(duì)于兩種受體的IS形成都是可有可無的，但CAR IS缺乏cSMAC內(nèi)Lck的聚集，并顯示出更無序的Lck微斑模式。因此，發(fā)現(xiàn)CAR IS的內(nèi)徑尺寸顯著更小，這與更快的CAR T細(xì)胞脫離相關(guān)。此外，大規(guī)模反相蛋白陣列鑒定出CAR T細(xì)胞中近端信號(hào)蛋白蛋白激酶C-delta（PKCδ）的快速下調(diào)，表明CAR啟動(dòng)的信號(hào)持續(xù)時(shí)間更短。這些發(fā)現(xiàn)得到了向IS加速遞送裂解顆粒的支持，導(dǎo)致更快的靶細(xì)胞殺傷。

形成穩(wěn)定的IS是T細(xì)胞誘導(dǎo)靶細(xì)胞殺傷的主要前提。一旦IS形成，效應(yīng)細(xì)胞可以利用不同的途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞裂解。

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二、穿孔素和顆粒酶

為了介導(dǎo)細(xì)胞溶解效應(yīng)功能，T細(xì)胞主要利用兩種主要途徑：含有穿孔素和顆粒酶的細(xì)胞毒性顆粒的胞吐作用，以及膜結(jié)合腫瘤壞死因子（TNF）家族配體的表達(dá)，這些配體與其各自的受體結(jié)合后誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。這兩種途徑可分為慢作用（TNF家族配體）和快作用（脫顆粒）殺傷機(jī)制。

為了確保快速而精確地殺傷感染或惡性靶細(xì)胞，細(xì)胞毒性顆粒錨定在效應(yīng)細(xì)胞的微管上。在免疫突觸形成后，顆粒向界面遷移并在cSMAC區(qū)域內(nèi)與質(zhì)膜融合。含有其細(xì)胞溶解有效載荷的囊泡被釋放到突觸間隙中，在那里穿孔素誘導(dǎo)靶細(xì)胞膜上的孔形成，以促進(jìn)促凋亡顆粒酶的進(jìn)入。一旦進(jìn)入靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，顆粒酶可以通過切割其關(guān)鍵底物來誘導(dǎo)caspase依賴性和非依賴性的凋亡性細(xì)胞死亡。

然而，在小鼠系統(tǒng)中，CD8細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞依賴于顆粒胞吐作用，而CD4 CTLs則利用Fas和Fas配體（FasL）途徑來介導(dǎo)細(xì)胞毒性，而在人類系統(tǒng)中，CTLs（包括CD8和CD4）主要利用細(xì)胞溶解的穿孔素和顆粒酶軸來介導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。此外，當(dāng)配備CAR時(shí)，兩個(gè)亞群的人類T細(xì)胞都可以以MHC和Fas獨(dú)立的方式有效根除腫瘤細(xì)胞。因此，穿孔素和顆粒酶的細(xì)胞溶解脫顆粒被認(rèn)為是CAR T細(xì)胞發(fā)揮重定向靶細(xì)胞殺傷的主要機(jī)制。

此外，CD4 T細(xì)胞與CD8 T細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)穿孔素和顆粒酶的表達(dá)量顯著較低。因此，CD4 CAR T細(xì)胞的有效靶細(xì)胞殺傷要么被延遲，要么需要更多的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量才能達(dá)到與CD8 CAR T細(xì)胞相當(dāng)?shù)募?xì)胞溶解。

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三、Fas和Fas配體（FasL）軸

經(jīng)典上參與非致病情況下的免疫細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，F(xiàn)as和FasL通路已被證明是多功能的，既有利于也有損于效應(yīng)T細(xì)胞。與鈣依賴性顆粒胞吐作用一起，鈣非依賴性Fas和FasL殺傷是T細(xì)胞裂解靶細(xì)胞的主要軸之一。CAR T細(xì)胞有能力利用這一途徑來介導(dǎo)腫瘤殺傷。

Fas和FasL途徑由Fas受體被Fas配體三聚化引導(dǎo)。這導(dǎo)致caspase 8的激活（由銜接蛋白Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（FADD）和pro-caspase 8介導(dǎo)，它們形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC））。活化的caspase 8然后負(fù)責(zé)下游pro-caspase 3的加工，形成成熟的caspase 3，caspase 3通過隨后切割超過500個(gè)細(xì)胞底物繼續(xù)介導(dǎo)細(xì)胞死亡，有效地執(zhí)行凋亡程序。研究表明，活化的CD30和CD19靶向CAR T細(xì)胞能夠以抗原獨(dú)立、細(xì)胞-細(xì)胞接觸介導(dǎo)的方式介導(dǎo)針對(duì)抗原陰性部分的腫瘤裂解。

總之，F(xiàn)as和FasL軸構(gòu)成了CAR T細(xì)胞在異質(zhì)性腫瘤環(huán)境中介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞裂解的另一種機(jī)制途徑。抗原非依賴性的旁觀者殺傷機(jī)制提供了一條可以在抗原丟失相關(guān)疾病復(fù)發(fā)背景下利用的途徑。此外，由于治療相關(guān)毒性的挑戰(zhàn)仍未解決，利用這一途徑可能有助于克服與穿孔素和顆粒酶介導(dǎo)的細(xì)胞毒性失敗相關(guān)的并發(fā)癥。

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四、細(xì)胞因子產(chǎn)生

雖然CAR T細(xì)胞設(shè)計(jì)基于通過直接的T細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞相互作用實(shí)現(xiàn)腫瘤裂解，但活化的CAR T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子可以進(jìn)一步增強(qiáng)其抗腫瘤能力。事實(shí)上，實(shí)體瘤病變具有巨大的表型多樣性，這對(duì)于依賴高度特異性和靶向方法的活體療法來說無疑是一個(gè)挑戰(zhàn)。CAR T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌通過次級(jí)機(jī)制在介導(dǎo)腫瘤裂解中起著重要作用。

已經(jīng)表明，HER-2特異性CAR T細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)腫瘤基質(zhì)上的干擾素γ受體表達(dá)，同時(shí)驅(qū)動(dòng)免疫細(xì)胞再教育（例如將巨噬細(xì)胞極化為抗腫瘤M1表型）。除了抗原特異性腫瘤細(xì)胞靶向外，CAR T細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的抗原非依賴性基質(zhì)破壞突出了CAR T細(xì)胞的另一種作用模式。

另外一個(gè)系統(tǒng)是使用用于通用細(xì)胞因子殺傷的重定向T細(xì)胞（TRUCKs）。這些CAR T細(xì)胞被用作在腫瘤組織內(nèi)分泌和介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞因子積累的載體。這種方法允許在腫瘤組織內(nèi)控制和定點(diǎn)遞送效應(yīng)分子，避免了其全身性遞送所遇到的問題。例如一種具有多效性功能的分子IL-12，可以激發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)。機(jī)制包括改善T細(xì)胞細(xì)胞溶解活性，募集和激活先天免疫細(xì)胞，以及重編程基質(zhì)相關(guān)的免疫抑制細(xì)胞。TRUCK方法依賴于通過CAR重定向T細(xì)胞遞送IL-12，同時(shí)以MHC非限制性方式靶向腫瘤相關(guān)抗原，實(shí)現(xiàn)了這一點(diǎn)。

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五、CAR T細(xì)胞作為連續(xù)殺傷者

理想情況下，ACT將以相對(duì)較少的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量介導(dǎo)腫瘤塊的快速破壞，確保更好地控制副作用。自然細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（如NK和CD8 T細(xì)胞）連續(xù)殺傷多個(gè)靶細(xì)胞的能力已被證明。同樣，CAR T細(xì)胞的連續(xù)殺傷潛力也得到了驗(yàn)證。

另一個(gè)重要方面是CAR T細(xì)胞產(chǎn)品中CD8和CD4 T細(xì)胞的比例。缺乏CD4 T輔助細(xì)胞可導(dǎo)致CD8 T細(xì)胞功能障礙和凋亡。通過將CD4 T細(xì)胞納入治療方案，它們?cè)谔峁┯行庖忒煼ㄖ械闹匾砸呀?jīng)變得明顯。這兩種細(xì)胞類型之間在動(dòng)力學(xué)和機(jī)制水平上的相互作用的重要性，通過觀察抗CD19 CAR CD8和CD4 CAR T細(xì)胞之間的縱向相互作用進(jìn)行了研究。單細(xì)胞分析顯示，CD4和CD8 CAR T細(xì)胞具有同等的腫瘤細(xì)胞殺傷能力，盡管前者需要更長(zhǎng)的結(jié)合時(shí)間和延遲的動(dòng)力學(xué)。

總的來說，很明顯，CD4 CAR T細(xì)胞介導(dǎo)殺傷的潛力可以進(jìn)一步增強(qiáng)CAR T細(xì)胞療法的療效。展望未來，需要確定和提供最佳的CAR T細(xì)胞亞群組成，這一領(lǐng)域已經(jīng)成為當(dāng)前臨床研究的焦點(diǎn)。

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六、CAR設(shè)計(jì)的親和力變化可以最大化殺傷效率

scFvs具有高度特異性，可以很容易地針對(duì)大多數(shù)感興趣的抗原生成，并且可以輕松地整合到高度模塊化的CAR設(shè)計(jì)中。使用scFvs的一個(gè)缺點(diǎn)是寡聚化的概率增加，這可能導(dǎo)致強(qiáng)直信號(hào)傳導(dǎo)。

許多CAR T細(xì)胞方法使用具有高親和力的scFvs。這主要基于先前的研究，這些研究表明CAR T細(xì)胞激活閾值與scFv親和力呈負(fù)相關(guān)。研究TCR刺激發(fā)現(xiàn)，存在一個(gè)理想的T細(xì)胞激活親和力窗口，因?yàn)檫M(jìn)一步的TCR親和力增強(qiáng)并未改善治療效果。與抗體或抗體偶聯(lián)藥物相比，CAR T細(xì)胞方法具有更高的靶標(biāo)靈敏度極限（幾個(gè)數(shù)量級(jí)）。由于在腫瘤部位特異性表達(dá)的腫瘤靶點(diǎn)如此之少，親和力調(diào)節(jié)需要更有效地用于更安全、更可控的CAR T細(xì)胞療法。

雖然scFv親和力對(duì)于CAR功能和增強(qiáng)殺傷潛力顯然很重要，但為了優(yōu)化功能，還必須考慮CAR設(shè)計(jì)的其他組成部分。

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七、優(yōu)化CAR T細(xì)胞功能和殺傷潛力

CAR T細(xì)胞可以被設(shè)計(jì)來增強(qiáng)其抗腫瘤效率。例如，被設(shè)計(jì)成分泌檢查點(diǎn)阻斷scFv的CAR T細(xì)胞被證明可以保護(hù)CAR T細(xì)胞免受免疫抑制性微環(huán)境的影響。此外，CAR T細(xì)胞已被改造為共表達(dá)免疫調(diào)節(jié)因子。通過同時(shí)表達(dá)這些因子，CAR T細(xì)胞不僅可以誘導(dǎo)抗原特異性抗腫瘤反應(yīng)，還能夠增加樹突狀細(xì)胞和其他T細(xì)胞對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)。

為CAR T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷接合替代信號(hào)通路在臨床前研究中證明非常有效。例如一種旨在激活Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK-STAT）通路的CAR構(gòu)建體。他們可以通過整合截短的IL-2受體β（IL2RB）鏈來激活STAT5，并通過在CD3z的C末端添加一個(gè)YXXQ基序來激活STAT3。這種CAR觸發(fā)了類似IL-21處理的基因表達(dá)譜，使T細(xì)胞具有獨(dú)特的功能，包括改善的增殖能力和優(yōu)于CD28-CD3z和4-1BB-CD3z CAR T細(xì)胞的效應(yīng)功能。

這些差異得到了進(jìn)一步探索。在彌漫性淋巴瘤異種移植模型中，CD28-CD3z CAR顯示出CAR CD3z鏈和CAR相關(guān)Lck的基礎(chǔ)磷酸化增加，導(dǎo)致更強(qiáng)的動(dòng)力學(xué)和信號(hào)強(qiáng)度，這與效應(yīng)T細(xì)胞樣表型和功能相關(guān)。這種信號(hào)強(qiáng)度部分歸因于Lck與該結(jié)構(gòu)域在CAR復(fù)合物中的組成性關(guān)聯(lián)。相比之下，4-1BB-CD3z CAR T細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)T細(xì)胞記憶相關(guān)基因，并在體內(nèi)對(duì)已形成的腫瘤表現(xiàn)出持續(xù)的抗腫瘤活性。

對(duì)CAR分子本身進(jìn)行的優(yōu)化是該領(lǐng)域一個(gè)持續(xù)的學(xué)習(xí)過程。隨著新的識(shí)別域或共刺激域星3式的出現(xiàn)，可能需要重新審視先前的優(yōu)化參數(shù)。

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結(jié)語

CAR-T細(xì)胞療法代表了癌癥免疫治療領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性突破，尤其在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中已展現(xiàn)出卓越的臨床療效。其核心作用機(jī)制依賴于CAR T細(xì)胞與靶細(xì)胞形成非經(jīng)典免疫突觸后，通過穿孔素/顆粒酶軸、Fas/FasL軸以及細(xì)胞因子分泌等多重途徑介導(dǎo)高效、精準(zhǔn)的腫瘤細(xì)胞殺傷。然而，該療法在實(shí)體瘤中的應(yīng)用仍面臨巨大挑戰(zhàn)，包括腫瘤微環(huán)境的抑制、靶抗原異質(zhì)性以及治療相關(guān)毒性等。

盡管挑戰(zhàn)猶存，但CAR T細(xì)胞療法模塊化、可編程的特性為其持續(xù)進(jìn)化提供了無限可能。隨著對(duì)CAR T細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制的更深入理解，以及人工智能輔助設(shè)計(jì)等前沿技術(shù)的融合，下一代CAR T療法有望在提升實(shí)體瘤療效、管理毒性及實(shí)現(xiàn)個(gè)性化治療方面取得根本性進(jìn)展，最終為更廣泛的癌癥患者帶來治愈希望。

參考資料：

Killing Mechanisms of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Int J Mol Sci. 2019 Mar 14;20(6):1283.

原文標(biāo)題 : 嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞的殺傷機(jī)制